Инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), довольно много – в настоящее время врачам известно более 25 таких болезней, при этом возбудители ИППП – это гетерогенная группа организмов: бактерии, грибы, простейшие, вирусы. Согласно статистике ежегодно в мире ИППП заболевают порядка 250 миллионов человек. Некоторые из ИППП относятся к безусловным патогенам и могут стать причиной бесплодия, невынашивания беременности, младенческой смертности. Правда, большинство ИППП излечимы, но прежде чем врач назначит лечение, инфекцию, естественно, следует определить и для этого существует множество лабораторных методов диагностики. Однако практика показывает, что диагностика ИППП – отнюдь не тривиальная задача: для достоверного выявления большинства возбудителей из этой группы требуется применение сразу двух и более методов диагностики.
К наиболее популярным в лабораторной практике методам тестирования ИППП в настоящее время относятся: культуральный метод, микроскопия в проходящем свете, иммунофлуоресцентный и иммуноферментный анализы, молекулярно-генетические методы, нацеленные на выявление ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) патогенна.
Об особенностях лабораторной диагностики ИППП мы беседуем с к.б.н., руководителем группы ПЦР инфекционных заболеваний компании «Вега» ГК Алкор Био Виталием Ведерниковым.
— Какие из ИППП наиболее распространены и представляют наибольшую опасность для здоровья человека?
— Если не считать такие тяжелые вирусные инфекции, как ВИЧ, гепатиты В и С, которые также могут передаваться половым путем, то к наиболее тяжелым последствиям для здоровья могут приводить такие распространенные бактериальные инфекции, как гонорея, хламидия и микоплазма гениталиум, из простейших — это трихомонада, вот четыре основных безусловных патогена. Сегодня в группу ИППП включены инфекции, которые принято считать условными патогенами – по-прежнему нет доказательств их вирулентных свойств: такие инфекции не опасны и нет острой необходимости их лечить, по крайней мере, до тех пор, пока их количество в организме не превысит некоей допустимой нормы.
— Какие подходы к диагностике ИППП сегодня являются основными?
— Существуют три основных подхода к диагностике ИППП. Это культуральный метод, бактериоскопия мазка с иммунофлуоресцентным мечением или без и тестирование с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот, в том числе ПЦР в режиме реального времени. А вообще методов диагностики ИППП множество, но ни один из них не является идеальным. К примеру, ранее «золотым стандартом» считался культуральный метод (выращивание патогена на культуре, посев), но, как показала практика, и его следует использовать не в отдельности, а в сочетании с другими методами диагностики. К тому же метод, признанный «золотым стандартом» для диагностики одной инфекции, может совершенно не подходить для диагностики другой инфекции.
— Расскажите подробнее о современных подходах к комплексной диагностике ИППП
— Рассмотрим в данном ключе три безусловных патогена: гонорею, трихомонаду и хламидию.
Начнем с гонореи. Рекомендуемый алгоритм обследования на гонорею в России и за рубежом практически не отличается. Общепризнанно, что оптимальным является проведение бактериоскопии (то есть после окрашивания препарат исследуют под микроскопом) с окраской по Граму в сочетании с культуральным методом. Такая комбинация методов обеспечивает высокие показатели чувствительности и специфичности. Специфичность бактериоскопического исследования достигает 96-99%, это связано с тем, что данная бактерия имеет четкую морфологическую форму (в виде кофейного зерна), поэтому под микроскопом ее можно довольно точно определить.
К сожалению, в РФ культуральное исследование на гонококк в большинстве случаев не проводится, а основным методом обследования является однократная бактериоскопия по Граму, при высокой специфичности, чувствительность которой при диагностике гонореи у мужчин с симптомами уретрита достигает 98%, а без симптомов 40-50%. Эффективность выявления гонореи бактериоскопическим методом для женщин значительно меньше – 80-50%, а по некоторым наблюдениям и 40-23%. Таким образом, очевидно, что при такой диагностике гонококковой инфекции высок риск получения ложноотрицательных результатов, особенно у женщин. Для повышения эффективности диагностики гонореи в качестве дополнительного метода исследования на гонококк может рассматриваться ПЦР. Так в Британском стандарте для микробиологических исследований указывается возможность использования ПЦР для определения гонореи в качестве подтверждающего исследования при условии предварительной валидации тест-системы. В РФ до настоящего времени метод ПЦР законодательно не введен в практику лабораторного обследования на гонококк, однако следует ожидать его внедрение в ближайшем будущем.
Наиболее оправданным на сегодня показанием для применения ПЦР в целях диагностики гонореи следует считать наличие клинико-анамнестических данных в пользу бессимптомного протекания инфекции.
Иммунологические анализы для диагностики гонореи практически не используются и, вероятнее всего, не будут активно внедряться.
Теперь поговорим о трихомонаде. Трихомонада — это единственное простейшее, обитающее в мочеполовых путях. Рекомендуемый алгоритм обследования на трихомониаз, по сути, ничем не отличается от алгоритма обследования на гонорею, представляя собой сочетание микроскопии и культурального метода, которое с наибольшей вероятностью обеспечивает получение достоверного положительного или отрицательного ответа при любой форме течения трихомонадной инвазии. Нередко для диагностики этого патогена проводится микроскопия нативных (влажных) препаратов, обнаруживают при этом живую трихомонаду. Очень непростая методика, поскольку проводить исследование необходимо максимально быстро после взятия биоматериала. Но зато, если обнаруживают живую трихомонаду – этого достаточно, чтобы поставить диагноз. Безусловно, кроме живых препаратов также изучают и фиксированные.
Ложноотрицательные результаты микроскопического исследования на влагалищные трихомонады неизбежны при безупречном проведении анализа, поскольку чувствительность этого метода даже в вагинальных препаратах составляет 40-80%, а в цервикальных мазках это простейшее обнаруживается у 60% пациенток с трихомониазом.
Проблема ложноположительных результатов наиболее часто применяемого в России микроскопического исследования на трихомонады с использованием окрашенных препаратов не менее актуальна, поскольку существуют объективные причины для гипердиагностики данного представителя простейших. Влагалищные трихомонады могут быть весьма вариабельны по размеру и форме, что нередко побуждает исследователя искать так называемые «атипичные формы», за которые могут быть приняты клеточные элементы, которые в процессе приготовления мазка в ряде случаев приобретают необычные морфологические характеристики. Таким образом, для повышения эффективности микроскопической диагностики следует учитывать трихомонады с характерной морфологией и/или характерной подвижностью. Любая же атипия является не дополнительным резервом эффективной диагностики, а реальным источником диагностических ошибок.
«Золотым стандартом» для выявления трихомонад считается культуральный метод. К существенным недостаткам этого метода можно отнести – длительность проведения анализа (3-17 суток) и дороговизна. Кроме того есть ограничения по жизнеспособности самих исследуемых патогенов.
Наиболее достоверные результаты обследования на трихомонаду могут быть получены при сочетании как минимум двух методов: микроскопия мазка – культуральный метод или микроскопия мазка – ПЦР.
Иммунофлуоресцентный анализ также используется для диагностики трихомониаза, однако отрицательный результат при использовании этого метода не является абсолютным, необходимо проводить дополнительные исследования. При бессимптомном течении трихомониаза часто применяется ПЦР – диагностика.
Исследование гуморального ответа при трихомониазе, как и при гонорее, в диагностических целях не регламентировано.
Что касается диагностики хламидиоза, то здесь, по-прежнему, «золотым стандартом» считается культуральный метод. Чувствительность этого метода может быть повышена за счет пересевания, но даже в этом случае чувствительность метода составляет 60-90%. По мнению ведущих российских специалистов Института Пастера (Санкт-Петербург), занимающихся изучением проблем диагностики хламидиоза, для выявления этой ИППП необходимо применение сразу трех методов: прямая иммунофлуоресценция (исследование препарата под микроскопом с использованием специфических антител к антигенам), культуральный метод и ПЦР. Используется и еще один метод диагностики — иммуноферментный анализ на наличие в крови специфических антител. При этом, в отличие от всех других ИППП, только для хламидий имеет смысл проводить иммуноферментный анализ на наличие в крови специфических антител, поскольку во всех остальных случаях генерализованный иммунный ответ на инфекцию возникает чрезвычайно редко, следовательно, невозможно определить антитела к конкретному патогену, ведь они просто не образуются. При хламидиозе вероятность появления антител выше, поскольку ярче выражен иммунный ответ организма на появление этого патогена, но, тем не менее, и здесь далеко не во всех случаях у инфицированного пациента наблюдается присутствие антител в крови. К примеру, когда проводились исследований в парах, оказалось, что даже если методом ПЦР хламидии были обнаружены и у мужчины и у женщины, в большинстве случаев антитела в крови присутствовали у женщины, а у мужчины – нет. Это связано с тем, что у мужчин данная инфекция гораздо реже вызывает генерализованный ответ. Как и для диагностики трихомониаза, для выявления хламидии необходимо, как минимум, сочетание двух методов. Наиболее оптимальными сочетаниями являются микроскопия мазка (с иммунофлуоресцентным мечением) – ПЦР и культуральный метод – ПЦР.
— Какова в целом роль ПЦР в диагностике ИППП?
— Внедрение в повседневную практику клинико-диагностических лабораторий ПЦР и других молекулярно-генетических методов исследования позволяет проводить экспресс-диагностику инфекционных заболеваний и, в некоторых случаях, дифференциальную диагностику и контроль эффективности проводимого лечения. Высокая чувствительность и относительная простота исполнения позволяет широко использовать ПЦР для диагностики ИППП. ПЦР анализ обладает высокой диагностической чувствительностью. И сама по себе процедура выявления патогенов таким способом является универсальной: в одном ПЦР — амплификаторе можно по одному протоколу проводить одновременный анализ нескольких патогенов. То есть один образец биоматериала пациента можно проанализировать сразу на несколько инфекций.
Считается, что положительный результат ПЦР анализа — это прямое указание на наличие возбудителя инфекции, потому что сам по себе метод ПЦР является очень специфичным. Но и здесь могут быть всевозможные варианты, например, нарушение правил пробоподготовки (выделение ДНК из биоматериала), из-за чего может быть получен ложноположительный результат или за счет контаминации продуктами амплификации. Сравнительно недавно внедренный вариант ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени позволяет значительно снизить вероятность возникновения ложноположительных результатов, поскольку благодаря дизайну исследования исключен этап открывания пробирок с амплифицированной ДНК для проведения последующей электрофоретической детекции. Кроме того в некоторых тест-системах введена система защиты от контаминации на основе фермента урацил-ДНК- гликозилазы. При проведении ПЦР в режиме реального времени детекция осуществляется в процессе прохождения реакции.
Для диагностики микоплазмы гениталиум и вируса паппиломы человека ПЦР анализ считается единственным адекватным методом, так как другими методами эта инфекция выявляется крайне плохо. Это связано с тем, что морфологически микоплазму практически невозможно отличить от других бактерий, на культурах она растет очень плохо.
ПЦР метод позволяет диагностировать латентную стадию инфекции, малосимптомные и бессимптомные варианты, когда не наблюдается воспалительный процесс. Особенно это касается урогенитального хламидиоза (УГХ): метод выделения этого возбудителя на культуре клеток, бывший до недавнего времени «золотым стандартом» диагностики УГХ, как уже упоминалось, имеет чувствительность 60-90% и уступает ПЦР по этому показателю. А в целом, цифры таковы: хламидиоз бессимптомно протекает почти у 80% зараженных этим возбудителем мужчин и у 50% женщин; присутствие трихомониаза не ощущают большинство мужчин и более 10% женщин, гонорея бессимптомно протекает у 10% мужчин и более 50% женщин.
Еще одно достоинство ПЦР анализа – возможность проведения количественной оценки. Это особенно актуально для диагностики условных патогенов из группы ИППП, поскольку лечение этих заболеваний рекомендуется начинать только при превышении определенной концентрации возбудителя в организме человека. Однако и у метода ПЦР есть свои ограничения: строгие требования к оснащению лаборатории, зависимость от качества тест-систем для проведения анализа и квалификация специалистов, что, впрочем, относится ко всем методам диагностики ИППП.
Типичной проблемой ПЦР — диагностики принято считать гипердиагностику, то есть перевыявление: там, где проблемы нет, мы видим положительный результат. К примеру, пациент пролечился, болезнь исчезла, а ПЦР анализ выдает положительный результат. Это связано с тем, что метод ПЦР показывает не наличие живого патогена, а присутствие ДНК этого патогена в организме человека. Поэтому, если сразу после курса лечения провести ПЦР тестирование, анализ покажет наличие ДНК, которая еще не успела исчезнуть из организма, хотя живых возбудителей инфекции уже нет.
Могут встретиться и новые изоляты ИППП, которые ранее не встречались, то есть патогены с мутациями и тогда есть вероятность, что метод ПЦР не сработает.
А в целом, практически любой положительный и, подчеркиваю, отрицательный результат, полученный при диагностике ИППП каким-то одним методом, необходимо проверять другим методом или методами. Выбор же методов диагностики зависит от возможностей лаборатории и квалификации специалистов.
